1. Transgene anjers: a. Waarom controleert men op de integratie van de plasmide backbone? b. Hoe controleer je dit via een Southern blot met behulp van 7 probes die de volledige backbone overspannen? c. Wat is een T-DNA locus? Twee niet-intacte en één intacte T-DNA zijn geïntegreerd op drie verschillende loci. Hoe komt het dat er twee niet-intacte en slechts één intacte kopie geïntegreerd zijn? Is de kans op een intacte integratie groot? (Er was een figuur gegeven met het T-DNA en een selectiemerkergen grenzend aan de LB).

2. Genbewerkte anjer: a. Waar ontwerp/kies je je sgRNA: meer naar de LB of meer naar de RB toe? Waarom zou je eventueel toch niet kiezen voor een positie dichter bij de LB, ondanks de aanwezigheid van een PAM-sequentie? b. Wat is de biologische functie van het PAM (Protospacer Adjacent Motif)? c. Wat zijn de gevolgen van vegetatieve vermeerdering voor planten die bewerkt zijn met CRISPR/Cas9?

3. Algemene gentechnologie vragen: a. Wat is Yeast Two-Hybrid (Y2H), hoe werkt het en van welke biologische functie/systeem is het afgeleid? b. Wat is auxotrofie? Bespreek dit ook in de context van selectiemerkers bij gist. c. Wat is een ori (origin of replication)? d. Wat is een MCS (Multiple Cloning Site)?

Tip: Er worden veel bijvragen gesteld tijdens het mondelinge gedeelte. Bestudeer de figuren uit de cursus grondig, met name die van T-DNA-constructen en plasmiden!

1. Er is een kort stukje tekst gegeven (3 expressiecassettes: Cry…, Cry… en PAT) uit een regulatory dossier van de EFSA: a. Waarop duidt de notatie "DAS-…-.."? b. Hoe werkt PAT? Waarvoor denk je dat dit gen hier werd gebruikt (als selectiemerker of als agronomic trait) en waarom? c. Wat wordt bedoeld met een single insert en waarom is dit belangrijk?

2. Een gensequentie is gegeven met aanduiding van een deletie die werd geïntroduceerd via CRISPR/Cas9: a. Waar knipt Cas9 precies? Duid dit aan op de figuur. b. Hoe is het sgRNA opgebouwd en waarvoor dient het? c. Hoe zal deze plant worden gereguleerd volgens het huidige voorstel van de Europese Commissie (EC) en de amendementen van het Europees Parlement (EP)? Waarom?

3. Je onderzoekt het NINJA-gen in planten en wil nagaan of dit gen meer of minder tot expressie komt bij verwonde planten. Hiervoor gebruik je qRT-PCR. Je beschikt over de gensequentie met aanduiding van introns, exons en UTR's (grafisch weergegeven in de opgave), alsook over verwonde en onbehandelde plantenbladeren.

   • Stel een gedetailleerd stappenplan op van hoe je dit experiment uitvoert.
   • Leg het principe van qRT-PCR kort uit (niet te gedetailleerd), en bespreek duidelijk de stappen die hieraan voorafgaan en de stappen die hierop volgen.

1. Genetic modification can be used to silence genes. Can you give an example where this is useful? Describe two methods to silence a gene. (One knock-out and one knock-down mechanism). What are the advantages and disadvantages?

   Example: DON'T use male sterility here! Genes against softening of your plant e.g. polygalacturonase. Knock-out: CRISPR/Cas9: there are 3 ways you can add no DNA (make sure to add here that it is knock-out when it is inside the coding region and when it causes a frame-shift), homologous DNA and non-homologous DNA. Knock-down: RNAi.

2. How to obtain potato plants resistant to late blight by genetic engineering? What genes do you need? Where do they come from? How do they work? What are the differences with breeding? What is the difference between cisgenic and transgenic potato?

   Bring in resistance genes from a wild potato variety, mostly work via gene-for-gene recognition. Cisgenic potato only contains the resistance gene from the wild relatives, transgenic potatoes can contain e.g. a marker gene for selection etc.

3. Describe the EU law of labeling of GMOs. How do they control this, with what technique? How can GMO's be detected? Which method is used to detect it? No need to explain the method in detail, but what info is needed and where can you get this info? How can you detect authorized and non-authorized GMO's and how are these regulated? (bijvraag: qPCR van welke regio?)

   Use (q)PCR to detect a GMO, for this you need the transition between the plant DNA and the insertion, this is needed to know the exact location of the insertion (every insertion location is another event). This info can be found inside the dossiers submitted to EFSA. The regulation is different when it comes to labelling, the amount of trace that can be present (0.9% or none). Non-authorized events can NOT come on the market.

30/05 afternoon

• What is CRISPR/Cas9? How does it work? Where does it come from? What happens in the plant? What is the outcome of adding a DNA fragment? How does the vector look like (which genes)? Can it also be transiently expressed? How? Why would you do that?
• What are male sterile plants? Explain. What are the advantages and disadvantages? How can you make the progeny fertile?
• How can GMO's be detected? Which method is used to detect it? No need to explain the method in detail, but what info is needed and where can you get this info? How can you detect authorized and non-authorized GMO's and how are these regulated?

• Genetic modification can be used to silence genes. Can you give an example where this is useful? Describe two methods to silence a gene. (One knock-out and one knock-down mechanism) What are the advantages and disadvantages? (For example: CRISPR/Cas to disable a gene (knock-out) and RNAi (knock-down))
• Genetic modification can make plants resistant to insects. Why and how (2 methods). What are the advantages and disadvantages or potential risks of this? (For example: Bt-plants, RNAi. Advantages: lower insecticide use, higher yield, more biodiversity, less toxic to farmers, ... Disadvantages: resistant insects)
• Describe the EU law of labeling of GMOs. How do they control this, with what technique? What information do they need to do this and where do they get this information from? (Control with DNA detection (qPCR), flanking regions are necessary, these can be found in the EFSA dossier of the GMO. Extra question here: what about oils that no longer contain DNA, how can it be controlled? Answer: traceability is documented in EFSA dossier.)

Versie 1

• Hoe kan je met Agrobacterium tumefaciens een transgene plant maken? Welke vector? Duid de belangrijkste zaken aan op deze vector. Hoe wordt DNA in de plant opgenomen en hoe gebeurt integratie in het genoom? Hoe kan je met deze vector een gen inactiveren? Geef voldoende andere mogelijkheden.
• Hoe kan je via genetic engineering een male sterile plant bekomen? Wat zijn de voor- en nadelen?
• In verschillende landen worden food samples onderzocht op GMOs. Hoe kunnen GMO's opgespoord worden? Hoe wordt onderscheid gemaakt tussen een geautoriseerde GMO en een niet-geautoriseerde? Wat is het gevolg hiervan? Hoe verschillen deze in regulatie?

Versie 2

• Hoe doe je nucleus- en chloroplast transformatie (welke vectors, hoe ga je te werk, toepassingen van chloroplast transformatie), voor- en nadelen chloroplast transformatie
• Herbicide resistentie: Roundup en Basta uitleggen en de voordelen en nadelen
• Hoe wordt een GMO goedgekeurd in EU? (ik had daar nog bijvraag: verschil met Amerika)

(TIP: veel schrijven, hoe meer je schrijft hoe minder vragen op het mondeling)

Versie 3

• Particle bombardment: Which vector is used? Draw the vector and mark the most important parts. How enters the DNA the cell and how is it integrated in the plant chromosome?
• CRISPR-Cas9 can be used for virus resistance in plants. Give 2 different methods how this can be used.
• EU legislation of GMO labeling and the control.

Versie 4

• CRISPR/Cas9: heel uitgebreid, vragen zoals: waarvoor gebruik je het, what is the purpose, advantages, disadvantages, in welke vector steek je het, hoe stel je de vectorconstruct op (wat ik niet had opgeschreven en waar ze dus wel naar vraagde was: je vectorconstruct bevat gRNA, Cas9 maar ook constitutive promotor zoals vb 35S) daarnaast wou ze ook weten hoe CRISPR/Cas9 ontdekt is dus hoe het in de natuur voorkomt: ontdekt in bacterie en als verdediging tegen virussen)
• Explain how plants can recognize pathogens (deel van Monica). Ze mikte op uitleg van protein mediated and RNA mediated resistance waarbij bij protein je dus movement en coat protein moest uitleggen, maar ook de mechanismes erachter (dus zo de movement via plasmodesmata)
• Geef een definitie van GMO, is dit je eigen definitie of is dit gebaseerd op een andere definitie en verklaar waarom je net die definitie geeft, en is volgens deze definitie a) irradiation en b) CRISPR/Cas een GMO

Versie 1

• Agrobacterium transformation: what is it? Which vector do you need? Can it be used for regeneration independent transformation?
• How to obtain potato plants resistant to late blight by genetic engineering? What are the differences with breeding? What is the difference between cisgenic and transgenic?
• Explain the EU regulation about labeling of GMOs

Versie 2

• Vergelijk vectoren die gebruikt worden om nieuw DNA in de nucleus in te voegen met vectoren om nieuw DNA in de chloroplast in te voegen. Wat zijn de voor- en nadelen van chloroplast transformaties? Wanneer kies je voor chloroplast transformatie? Wat zijn de toepassingen?
• Wat is 'pharming'. Geef voor- en nadelen en toepassingen. Geef een voorbeeld om proteïnen te zuiveren uit zaden (met oil bodies).
• Ben je het eens of oneens met volgende stelling: 'GMO's zorgen voor monocultuur omdat over heel de wereld dezelfde variëteit van bijvoorbeeld Bt-cotton gebruikt wordt.' Geef meer info over regulatie, GMO-event en technieken.