Casus: Proteïne B heeft een KDEL-sequentie: cDNA gekend, polyklonaal antilichaam beschikbaar, geglycosyleerd, waargenomen grootte $50\text{ kDa}$ (de voorspelde aminozuursequentie telt 545 AA).

1. Geef de synthese, maturatie, mogelijke modificaties, glycosylatie en degradatie.

2. Welke techniek (kies er één) kan worden gebruikt om onbekende interactiepartners van proteïne B op te sporen? Veronderstel dat je 6 interactiepartners hebt gevonden; hoe bevestig je deze interacties?

3. Bespreek de twee getoonde figuren (methodologie + conclusie):
   • Figuur 1: Yeast Two-Hybrid (Y2H) experiment.
     • Bijvraag: "Can you hypothesise where these proteins will be located in the cell?"

• Figuur 2: Western blot ter detectie van fosforylatie.
  • Bijvraag: "Why does the kinase give such a strong signal?"

Versie 1:

Casus: Proteïne met een KDEL-sequentie: aminozuursequentie gekend (545 AA), cDNA gekend, polyklonaal antilichaam beschikbaar, geglycosyleerd, waargenomen grootte $50\text{ kDa}$.

1. Bespreek de synthese, maturatie, glycosylatie en degradatie van dit eiwit.
2. Interactiepartners opsporen:
   • Welke techniek is het meest geschikt (most suited) om interactiepartners op te sporen wanneer je géén zuivere eiwitfractie hebt? Leg de techniek uit en motiveer waarom dit de beste optie is.
   • Met welke andere techniek kan je, nadat je 6 potentiële interactiepartners hebt gevonden, deze interacties daadwerkelijk valideren/bevestigen?
3. Figuren bespreken:
   • Figuur 1: Foto van een Yeast Two-Hybrid (Y2H) assay. Volledig toelichten en alle componenten benoemen.
   • Figuur 2: Foto van een 2D-elektroforese gel. Volledig toelichten en benoemen.

Versie 2:

Casus: Receptor Protein C met een GPI-anker. Bevat meerdere N- en O-glycosylaties. Polyklonaal antilichaam is beschikbaar en de sequentie is gekend.

1. Discuss synthesis and maturation of protein C. How can we detect glycosylation? Discuss the degradation.

2. Which technique (give only one) can be used to detect unknown protein C interactors? We found 3 possible interaction partners; how can you confirm that they truly interact with protein C?

3. Discuss 2 given figures: methodology + conclusion:

Versie 1:

Casus: Protein H is a nuclear protein of $50\text{ kDa}$. It is glycosylated and phosphorylated. There is no sequence available. Purified protein H and a polyclonal antibody are available.

1. How does the synthesis and maturation of this protein happen? What modifications can happen? How does glycosylation happen? How is the protein degraded?

2. How would you find the interacting partners of protein H? Design an experiment. How would you confirm this interaction using a second technique?

3. (Enkel schriftelijk) How are 2D electrophoresis and mass spectrometry useful to study proteomics? What are they used for? What are the alternatives?

   Tip: Het volstaat te beschrijven waarvoor de technieken worden ingezet; een gedetailleerde technische uitwerking van de apparatuur is niet vereist.

4. Discussion of your article.

Versie 2:

Casus: Protein F is a cytosolic protein with a molecular weight of $60\text{ kDa}$. It is glycosylated. The entire protein sequence is known and there are no antibodies available.

1. Give the complete synthesis and maturation of protein F. What modifications can be expected? What glycosylations are possible? How will it be degraded?
2. How will you identify any possible interaction partners of protein F? Design the experiment. How will you confirm the interaction partners?
3. Explain the principle of Edman degradation. What is it used for? What are the alternatives?
4. Discussion about article assignment.

Casus: Protein F is a cytosolic protein. It is glycosylated. There are no antibodies available.

1. Give the synthesis and maturation of the protein.
   • Mondelinge bijvragen:
     • Worden proteïnen enkel in het cytosol geproduceerd?

 - Verschillen cytosolische ribosomen qua samenstelling van membraangebonden ribosomen? 

 - Zijn er nog andere modificaties die in het cytosol kunnen gebeuren? 

2. How does glycosylation take place?

• Bijvraag: Will a cytosolic protein always stay in the cytosol?

3. How does degradation take place?
   • Bijvraag: Why can a proteasome degrade proteins?

4. How can you look for interaction partners of protein F? Explain the steps of your chosen method. How can you verify the interactions?

• Mondelinge bijvragen:
  • BiFC maakt gebruik van labeling/tags. Wat vind je hiervan?

 - Zijn dit kwantitatieve methoden? 

 - Wat is een kwantitatieve methode om interacties te meten? 

5. Explain how 2D electrophoresis and mass spectrometry can be used for proteomics. Give the applications and alternatives. (Enkel schriftelijk).
6. Vragen bij het artikel:
   • Leg uit hoe BiFC fluorescente proteïnen benut.
   • Wat is het verschil tussen monoklonale en polyklonale antilichamen?